原因1：样本中的杂蛋白影响了介质与目的蛋白的亲和

原因2：操作或介质选择不当

原因1：目的蛋白不挂柱

原因2：目的蛋白结合弱

原因3：目的蛋白洗脱不下来

缓冲液pH≥目的蛋白pI 0.5-3个单位，蛋白带负电，选择弱阴离子交换填料(DEAE)；

缓冲液 pH≥目的蛋白pI 3个蛋白以上，蛋白带负电，选择强阴离子交换填料(Q)；

缓冲液 pH≤目的蛋白pI 0.5-3个单位，蛋白带正电，选择弱阳离子交换填料(CM)；

缓冲液 pH≤目的蛋白pI 3个单位以上，蛋白带正电，选择强阳离子交换填料(SP)；

缓冲液中含有较高离子强度时选择复合型离子交换填料(MMC/MMA)。

强阴/阳离子交换剂：适用pH范围广，pH范围内结合效果更稳定；

弱阴/阳离子交换剂：适用pH范围窄，载量随着pH变化，分辨率较高；当用强阴/阳离子无法满足分离效果时，可以选择。

Streptactin Beads 4FF建议用脱硫生物素洗脱，不能用D-生物素洗脱，原因是D-生物素与填料结合非常紧密，高浓度氢氧化钠清洗后载量只能达到初始载量的 50%左右。每次用完都需要再生。

STarm Streptactin beads 4FF洗脱液为D-生物素，可以耐受高盐和变性剂等试剂，也可以在微量游离生物素浓度下结合目的蛋白。使用完后可以用PBS进行清洗，无需每次再生。

Streptavidin Beads 6FF适用于生物素化蛋白、抗体等组分的亲和；

Streptactin Beads 4FF适用于Strep-tag Ⅱ标签融合蛋白、Twin Strep-tag Ⅱ标签融合蛋白的亲和。

（1）血清可先用Protein G预处理，在培养前除去IgG。或选用IgG含量较低的血清。

（2）样品先用Protein A或G纯化，得到的抗体再经过疏水层析除去牛IgG。

（1）首先看样品是否结合，抗体种属亚型与亲和填料是否有亲和力，结合缓冲液pH是否中性，流穿中抗体是否有减少，可将原始样品和流穿同时跑SDS-PAGE电泳进行分析。

（2）再看样品是否与填料结合太牢固，没有洗脱下来，建议用pH更低的缓冲液洗脱。

（3）洗脱后酸性条件下抗体是否水解，可在收集管中预先加入中和液或精氨酸等保护剂，或者选择能在近中性条件下洗脱的填料。

（1）洗杂是否完全？可取zui后洗杂液跑SDS-PAGE电泳进行分析。

（2）适当提高结合时盐离子浓度，或在洗杂液中加入低浓度的非离子型去垢剂，降低非特异性吸附。

（3）上样前样品预处理，除去部分杂质。

（4）采用两步纯化，先亲和层析纯化，后经离子交换层析，除去HCP 、脱落的 Protein A以及部分聚体等等，得到纯度更高的抗体。

（1）Protein L可以特异性的结合抗体的κ轻链，因此，只要Fab 片段中含有κ轻链，就可以选择Protein L填料进行纯化。

（2）Protein G 除了可以特异性结合IgG 的Fc 片段，还可以特异性低亲和的与某些抗体Fab片段结合。

（3）Protein A只结合IgG的Fc片段。采用流穿模式，将纯的IgG酶解后过Protein A填料，Fab在流穿峰，Fc片段结合在填料上。

（1）更换亲和力更高的填料。

（2）对于Protein A填料，结合pH可以升至8-9。

（3）填料多次使用后残留物增多，载量降低，建议用6M盐酸胍或70%乙醇清洗填料。对于耐碱填料可以使用0.1-0.5M NaOH清洗。

（1）通常采用沉淀法结合凝胶过滤法纯化IgM，但对于大量纯化抗体，这种方案繁琐且产量低。

（2）采用Protein L亲和填料，特异性的结合κ轻链，对纯化抗体片段及完整地抗体IgG、IgM和IgA很有用。

（3）嗜硫填料是根据其配基与抗体间的二硫键产生特异性相互作用，中性条件下吸附、洗脱，纯化后蛋白活性高，是一种通用型抗体纯化手段。

最常用的预处理方法是沉淀法。对于腹水中的脂蛋白，常用硫酸右旋葡糖酐沉淀，或是在pH=7时，采用PVP沉淀b-脂蛋白和球蛋白。上样时若腹水样品太粘稠可以使用上样缓冲液稀释样品。对于白蛋白等杂蛋白，可以使用分级沉淀法去除，如硫酸铵沉淀、羊脂酸沉淀等。利用脱盐柱或透析可以除去盐离子并更换缓冲液。