pSmart Ⅰ载体 ：

酿酒酵母SUMO家族SMT3蛋白位于第四条染色体上，是类泛素蛋白，可以通过SUMO连接酶连接到目标蛋白的赖氨酸侧链上，调节了细胞的染色体分节，DNA复制等重要的生理过程。但对于做大肠杆菌原核表达的人来说，它促进其它蛋白可溶性表达的能力，才是更重要的性质。SUMO蛋白本身分子量较小，只有一百多个氨基酸残基，比经典的GST蛋白小了一半以上，融合表达时不会占用宿主太多资源。更完美的是：它可以被ULP蛋白酶识别空间构象，特异性的从融合蛋白上切除。在此之前只有泛素（Ubiquitin）融合表达系统有类似的性质。但是SUMO的促溶解性能远远高于Ub，当SUMO融合表达体系流行起来的时候，已经很少有人记得曾经的Ub融合表达系统了。

和传统的GST，MBP，TRX等经典的融合表达载体相比，SUMO的确更有效。pSmart-I 载体是在pET-28a载体的基础上改造而来，主要改造是将编码SUMO蛋白的核酸序列接入到pET-28a载体中，保留了原载体的整体框架以及多克隆酶切位点。

pSmart Ⅱ载体：

IF2蛋白是大肠杆菌的翻译起始蛋白之一，它同时和核糖体、tRNA、mRNA等翻译元件相互作用，调节了大肠杆菌的蛋白翻译。这一个蛋白的N-端有三个结构域，有较强的亲水性，同时结构域I能够强烈促进IF2蛋白截短体表达。因此，Mortensen等人推测IF2的N-端部分可能促进重组蛋白在大肠杆菌中的可溶表达。于是他们使用了链亲和素（Strepavidin, SA）作为测试目标，以MBP、NusA两个融合蛋白为正对照，进行了对比研究。发现IF2的结构域Ⅰ-Ⅲ可以促进重组蛋白的可溶表达并提高表达量。考虑到效率，他们选定了IF2蛋白结构域I的158个氨基酸残基作为促进可溶表达的融合蛋白标签，并报道了此标签可以促进单链抗体ScFV的可溶表达。

其实，IF2 domain I标签蛋白促进可溶表达的能力，并不比MBP、NusA强多少。但它分子量较小，对于目的蛋白表达量的提高有明显的帮助。所以我们把这一标签蛋白克隆到到pET-28a载体中，保留了原载体的整体框架以及多克隆酶切位点，用作pSmart-I载体的补充。

pSmart Ⅲ载体  ：

大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（MBP）是经典的融合蛋白标签，广泛使用。MBP具有一定的伴侣蛋白作用，可以促进融合蛋白的折叠。同时，MBP自身拥有较好的水溶性以及较高的表达量。更重要的是：MBP可以和麦芽糖结合，通过Dextrin亲和介质，一步亲和纯化即可以获得很高的纯度，麦芽糖底物竞争洗脱的条件也十分温和，有利于保持目标蛋白的活性。

MBP本身的分子量超过40kDa，因此相对来说，会占用宿主较多的资源，目标蛋白的最终产量不会太高。同时由于未知的原因，MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达的时候就容易降解。但由于其使用的历史悠久，有专门的亲和填料，也有许多成功的案例。因此，我们构建了pSmart-III载体系统，MBP标签蛋白序列被克隆到到pET-28a载体中，增加了N-端His6-tag用于纯化，保留了原载体的整体框架以及多克隆酶切位点，供大家使用。

pSmart Ⅳ载体 ：

早期筛选大肠杆菌融合蛋白表达体系主要靠个人经验和感觉，有人做过Ubquitin、EGFP、DsbA等融合表达体系。但是由于这些体系的明显缺陷，最终并没有流行起来。随着经验积累，有研究者提出了一个Wilkinson–Harrison溶解性模型，通过这一经验公式，可以计算某一个蛋白在大肠杆菌中可溶表达的概率。NusA就是这样被挑选出来作为融合表达标签蛋白的。

大肠杆菌的NusA蛋白是一个抗转录终止因子，约55kDa大小。自身水溶性很好，同时又是大肠杆菌的内源蛋白，拥有极高的的表达水平。有人使用NusA融合表达体系，测试了人的γ-干扰素，白介素IL-3等蛋白在大肠杆菌中的表达，都获得了可溶产物。我们使用NusA也实现了RNase抑制剂的可溶表达。另外NusA也可能对于稳定转录有些帮助。因此，我们构建了pSmart-IV载体系统，NusA标签蛋白序列被克隆到到pET-28a载体中，保留了原载体的整体框架以及多克隆酶切位点。使用时请注意，NusA本身太大了，即使表达量较高，最终获得的目的蛋白的水平也不如pSmart-I载体。

pSmart Ⅴ载体：

Wilkinson–Harrison溶解性模型中，主要考虑八种氨基酸残基的比例，即亲水氨基酸的比例以及蛋白的净负电荷数量（对应指标为：NGPS%，DE-KR%）。Davis等人的确使用此模型获得了一些成功。2007年华东师范大学的Su等人利用此模型进行了一系列融合标签蛋白筛选。他们利用绿色荧光蛋白（GFP），牛肠激酶（EK蛋白酶）作为研究模型，比较了SUMO，MsyB等蛋白的促溶解性。结果符合Wilkinson–Harrison模型，MsyB的表现超过了SUMO。

MsyB是一个强酸性蛋白，来自于大肠杆菌本身，被认为与蛋白转运有关。它只有124个残基，但是在pH7.0时，有33个净负电荷，很好地符合了Wilkinson–Harrison模型。MsyB和SUMO的性质有些类似，表观分子量也比实际分子量要大一些。我们把这一个蛋白克隆到pET-28a载体的骨架中，构建了带有His6-tag纯化标签以及TEV蛋白酶切位点的表达载体，命名为pSmart-V。

pSmart VI载体 ：

Strep-tag II是一个由8个氨基酸（Trp-Ser-His-Pro-Gln- Phe-Glu-Lys）构成的短序列，能够和Streptactin特异性的结合， 两者的亲和力比Strep-tag II和Streptavidin高100倍以上。因此Strep-tag II是一个很好的能够达到单步纯化既有很好纯度的标签，而且纯化条件温和，能够很大程度上保证目的蛋白的活性。

Twin Strep-tag II保留Strep-tag II高特异性和温和纯化条件的基础上，拥有更高的亲和力。因此，可以用于直接从培养上清中进行目的蛋白的纯化。此外，它能承受不同的缓冲条件和添加剂（如：高盐、洗涤剂、还原剂，金属离子和螯合剂等），使它成为不同蛋白质的通用标签，特别是蛋白质相互作用分析中的蛋白质复合物。

因为Strep-tag II标签较小，不干扰目标蛋白的折叠和生物活性，对重组蛋白的影响可以忽略不计，因此无需去除该标签。

在此基础上，我们开发了Twin Strep-tag II标签原核表达载体，该载体是在 pET-28a 载体的基础上改造而来，设计时我们在标签后插入了SUMO蛋白的核酸序列，促进蛋白的可溶性。预留了多克隆酶切位点，方便基因片段的插入，建议克隆方式为无缝克隆（这种方式不会额外增加氨基酸）。此外载体上我们还添加了RFP标签的核酸序列，可以应用于蛋白表达的阳性对照使用。pSmart VI载体可以配套我们公司的STarm Streptactin Beads 4FF介质进行使用。